桃子師姐的lncRNA探索之旅

2020-02-27

國自然撰寫之lncRNA篇

LncRNA從2011年開始進入國自然基金申請的競選中,后面開始發揮其獨特魅力,基本保持增長狀態,到2019年關于lncRNA項目中標數量達到356個,合計金額14212.1萬,雖然和2018年的365個(14899.32萬)相比有所下降,但是可以預見2020年關于lncRNA的研究項目基本還是能保持在300個以上的,所以2020年基金選擇lncRNA也是一個不錯的選擇。

表1:lncRNA研究項目近年中標基金項目統計

圖片來源網址:https://www.letpub.com.cn/index.php?page=grant#fundlisttable

lncRNA是長度大于200個核苷酸的長非編碼RNA (long non-coding RNA),許多lncRNA包含一個5 '帽、多個外顯子和3’聚腺苷酸、lncRNA其中一些轉錄本是基因間的,而另一些轉錄本是由接近或部分重疊于蛋白編碼基因的基因組區域產生的。根據與鄰近編碼基因的相對位置,lncRNA一般可分為基因間、反義、發散、內含子和增強子lncRNA,其可以定位在細胞核和細胞質中,由于高通量測序技術的普及,越來越多的lncRNA被發現,同時也有文獻報道lncRNA參與調控各類疾病,例如腫瘤、高血壓、缺血性中風、脂肪形成等[1-4]。

 

LncRNA參與調控疾病的主要調控方式為:①通過miRNA起作用,作為miRNA的前體,ceRNA機制吸附miRNA等;②調控circRNA,可以作為circRNA的前體,可以和circRNA競爭性結合miRNA等;③直接調控基因,可以作為mRNA轉錄的增強子促進mRNA轉錄,可以和DNA結合調控DNA的修飾影響轉錄;④參與調控蛋白,lncRNA可以翻譯蛋白,lncRNA能夠和轉錄因子、RNA調控相關酶結合改變基因的轉錄、穩定性和翻譯,也能和蛋白結合影響蛋白的活性[4-11]。

圖1:lncRNA作用方式簡圖

A. B圖片參考文獻:Transcriptional and Post-transcriptional Gene Regulation by Long Non-coding RNA

C圖片參考文獻:The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1

2019年主題是lncRNA的研究申請的基金項目總共有6類,包括重點項目、聯合基金項目、面上項目、地區科學基金項目、青年科學基金項目和國際(地區)合作與交流項目,其中最多是青年科學基金項目、其次是面上項目

表2:15個2019年中標的申請基金項目簡介

下面以2篇已經中標的lncRNA研究的青年基金摘要進行講解一般lncRNA研究方案

01

長鏈非編碼RNA在鎘毒作用中的表達譜篩選及功能研究,金額23萬

摘要:

研究顯示:長鏈非編碼RNA(lncRNA)與DNA損傷與修復、DNA甲基化及組蛋白乙?;嘘P。項目申請人在前期研究發現,鎘能引起DNA損傷與DNA修復基因表達下調,并引起異常甲基化和乙?;?。但其機制是否與lncRNA的調控有關?未見報道。本項目擬通過高通量的LncRNA芯片和生物信息學技術篩選出鎘惡性轉化人支氣管上皮細胞(16HBE)中LncRNA差異表達譜,通過鎘作業人群進行驗證,并進一步運用LncRNA過表達技術和LncRNA沉默技術探索和驗證鎘毒作用中LncRNA在細胞周期,細胞凋亡、DNA損傷、DNA修復和DNA甲基化和組蛋白乙?;械恼{控功能;經過表遺傳逆轉,探索LncRNA和甲基化和乙?;幕フ{控作用。本項目將為尋找LncRNA作為鎘毒早期生物標志物的研究奠定基礎,為探討鎘毒性和致癌機制研究提供新的思路,對闡明LncRNA在鎘毒性中的的調控功能有積極的意義。

 

研究套路為:

1) 探索要研究的小領域是否有做過lncRNA研究,如果沒有后續可以通過高通量測序發現新的lncRNA參與調控該領域

2) 驗證篩選的lncRNA的作用,一般是從細胞和動物水平進行驗證

3) 尋找lncRNA作用機制

02

RERT-lncRNA調控EGLN2在肝細胞肝癌發生中的作用機制研究,金額23萬

摘要:

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在基因組中廣泛表達并以RNA的形式在多種層面調控基因表達。已有研究表明lncRNAs的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關。我們近期的研究發現:位于prolyl羥化酶(EGLN2)遠端啟動子的一個遺傳多態(rs10680577)與肝細胞肝癌(HCC)的發生、預后及EGLN2表達存在顯著性相關,而這種相關不是該多態影響EGLN2啟動子的轉錄而調控其表達。我們注意到EGLN2及其上游基因間存在一個通讀長鏈非編碼RNA(RERT-lncRNA),我們推測該多態可能通過影響長鏈非編碼RNA的表達從而實現對其下游基因EGLN2的調控,進而參與HCC的發生和預后。本課題擬采用基因型-表型關聯結合功能實驗方法研究遺傳多態、RERT-lncRNA和EGLN2三者間的依存關系及其對腫瘤細胞特征的影響,以期闡明遺傳因素-lncRNA-EGLN2通路在HCC發生發展中的作用機制。

    

 研究套路為:

1) 找要研究領域里已經研究過關鍵因子可能有關聯lncRNA,可以是同一基因來源附近的lncRNA轉錄本,也可能是該基因能夠作用的miRNA對應的lncRNA,也可能是通過預測能夠和關鍵因子結合的lncRNA,還有可能是在比較關聯研究領域有研究過的lncRNA

2) 驗證根據前期調研篩選的lncRNA在本研究領域中的作用

3) 研究lncRNA作用的關鍵分子的調控作用

4) 最后在臨床樣品中進行驗證lncRNA、關鍵分子的定位和表達,以及與臨床病理的相關性

   

一般lncRNA研究會涉及到實驗技術有:

1) lncRNA干擾或過表達后檢測lncRNA的功能:干擾片段的構建,過表達質粒的構建,lncRNA過表達或是干擾慢病毒構建,利用CrisprCas9來構建lncRNA過表達或敲除穩定株

2) 研究lncRNA與miRNA/mRNA/蛋白相互作用:利用lncRNA探針進行RNA pull down后QPCR或是測序檢測與其結合的RNA、western blot或是質譜檢測和結合的蛋白檢測,IF/FISH/ISH/IHC檢測lncRNA和其作用的分子的共定位

3) 研究lncRNA能夠sponge miRNA,lncRNA能夠促進mRNA的轉錄:熒光素酶報告基因檢測

4) 如果涉及到動物實驗,需要根據要研究的領域選擇相應動物模型,進行lncRNA的檢測或是lncRNA干預LncRNA無論是從中標率、可行性分析、以及后續文章發表來看,都是你國自然基金研究主題選擇之一

廣州庫基生物是廣州永諾生物旗下專注科研服務的全資子公司,擁有SPF級動物房,具有全面的分子生物實驗、細胞實驗平臺、病理實驗平臺,同時擁有先進的高通量測序平臺、單細胞測序平臺和強大的生物信息學分析團隊,更擁有強大的課題設計和執行腦力支持??梢蕴峁㎜ncRNA研究所涉及到慢病毒構建、穩定株構建、RNA pull down、RNA高通量測序、蛋白質譜鑒定、熒光素酶報告基因檢測、以及轉基因和疾病模型的動物相關檢測實驗服務,能夠解決你研究lncRNA的所有顧慮,助力你獲得國自然基金。 

我們后續將從m6A、外泌體、circRNA、單細胞測序、腸道微生物這幾個方面繼續分析國自然撰寫,歡迎持續關注我們

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